THESIS: Candela Machuca

17oct10:3012:30THESIS: Candela MachucaGeneración de un modelo de células de Purkinje de cerebelo para el estudio de dos enfermedades raras neurodegenerativas: PLAN Y ARSACS10:30 - 12:30 Event Type TESIS

Event Details

Defensa de Tesis Doctoral:

Generación de un modelo de células de Purkinje de cerebelo para el estudio de dos enfermedades raras neurodegenerativas: PLAN Y ARSACS

Doctorando: 

Candela Machuca

PhD. Supervisors:

Carmen Espinós

Slaven Erceg

Enrique Lanuza

Resumen:

Las células madre humanas pluripotentes inducidas derivadas de pacientes (hiPSCs) proporcionan la oportunidad de recapitular la patogenicidad de las enfermedades sin necesidad de manipulación genética y/o la creación de modelos animales genéticamente modificados. Las nuevas tecnologías con hiPSCs están siendo desarrolladas para crear neuronas humanas y tener el potencial de mejorar la comprensión de los mecanismos subyacentes de las enfermedades neurológicas, neurodegenerativas y del desarrollo. La atrofia cerebelosa es una condición asociada a enfermedades neurodegenerativas como la ataxia autosómica-recesiva de Charlevoix-Saguenay (ARSACS) (OMIM: 270550) y a la neurodegeneración asociada a PLA2G6 (PLAN) (OMIM: 610217). ARSACS es un trastorno neurodegenerativo de aparición temprana, causado por mutaciones en el gen SACS y caracterizado por presentar atrofia en el cerebelo superior.

PLAN, es una enfermedad ultra rara neurodegenerativa que se engloba en el grupo de las NBIA (Neurodegeneración con acumulación de hierro, en inglés con Neurodegeneration with Brain Iron Acumulaction) y es causada por presentar mutaciones en el gen PLA2G6. Se caracteriza por presentar distrofia neuroaxonal y ataxia cerebelosa. El objetivo de esta tesis fue generar un modelo de Células de Purkinje del cerebelo (CPCs) que permitiese posteriormente estudiar la neurodegeneración cerebelosa en estos pacientes. En este trabajo se ha utilizado un protocolo de diferenciación celular utilizando fibroblastos reprogramados con Sendai virus a hiPSCs, de pacientes ARSACS y PLAN que ha permitido generar con éxito un modelo CPC funcional utilizando el protocolo descrito por el grupo del Dr. Sahin [Mol Psychiatry 2018; 23: 2167-83] para cada línea celular de cada paciente. Posteriormente se caracterizaron los nuevos modelos, CPC PLAN y CPC ARSACS, mediante el análisis de la expresión de genes y proteínas involucradas en el hierro metabolismo, peroxidación lipídica, ferroptosis y autofagia en pacientes PLAN y de citoesqueleto, proteasoma y marcadores de autofagia en pacientes en pacientes ARSACS. En pacientes PLAN, los resultados obtenidos mostraron un posible deterioro de la ferritinofagia, debido a las alteraciones en la expresión de la ferritina y NCOA4 entre otros marcadores alterados, así como un aumento de los niveles de peroxidación lipídica.

También se analizaron las alteraciones en genes relacionados con la respuesta antioxidante y la expresión de genes relacionados con la ferroptosis. Los resultados obtenidos apuntaron a que los mecanismos de ferroptosis, el metabolismo del hierro y la autofagia podrían estar desregulados en pacientes PLAN, pudiendo contribuir así al desarrollo de la enfermedad y muerte neuronal. Los resultados obtenidos del modelo CPC de pacientes ARSACS indicaron una posible disfunción de la vía de autofagia y una alteración en la expresión de genes relacionados con el ensamblaje del citoesqueleto. Además, en las CPC maduras de pacientes ARSACS y en CPC de portadores sanos de la enfermedad se observaron acumulaciones de neurofilamentos genotipo-dependiente, al igual que otros modelos animales de la enfermedad de ARSACS habían reportado anteriormente, mostrándose así este suceso como característica principal de la enfermedad de ARSACS. También se analizaron parámetros relacionados con la respiración mitocondrial y bioenergética usando un analizador Seahorse XFe96 para confirmar que la función mitocondrial se encontraba alterada en ambas enfermedades. Finalmente, se examinaron las propiedades electrofisiológicas intrínsecas de las CPC maduras de ambos modelos mediante la técnica whole cell patch clapm, así como la morfología neuronal final. La disfunción mitocondrial observada y las propiedades electrofisiológicas anormales de las CPC de pacientes y portadores de mutaciones en PLA2G6 y SACS en heterocigosis y homocigosis indicaron que la expresión normal de estos genes es importante para el desarrollo y la funcionalidad de las CPC. Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis doctoral mostraron que el modelo CPC PLAN y CPC ARSACS reproduce fielmente la fisiopatología subyacente y, por lo tanto, es adecuado para la detección de drogas y la obtención de terapias para estas enfermedades en un futuro próximo.

Time

(Monday) 10:30 - 12:30

Location

Centro de Investigación Príncipe Felipe

Eduardo Primo Yúfera, 3 Valencia Spain

Organizer

Centro de Investigación Príncipe Felipe

Eduardo Primo Yúfera, 3

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