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Title: Development and validation of novel senolytic strategies for targeting and eliminating senescent cells

Autor: Blanca Escriche Navarro
Directors: Prof. Ramón Martínez Máñez, Dra. Alba García Fernández y Prof. Félix Sancenón Galarza

Abstract: Esta tesis doctoral titulada “Desarrollo y validación de nuevas estrategias senolíticas para la selección y eliminación de células senescentes” se centra en el diseño, síntesis y validación de nanodispositivos y profármacos para eliminar células senescentes, con el objetivo de tratar enfermedades relacionadas con el envejecimiento y el cáncer. En el primer capítulo experimental, presentamos un nanodispositivo para eliminar selectivamente células senescentes explotandola actividad enzimática específica del secretoma senescente. Los resultados mostraron que tras la inducción de senescencia en fibroblastos WI-38 proliferantes con radiación ionizante, las células secretan altos niveles de metaloproteinasa de matriz 3 (MMP-3). Basándose en esto, se cargaron MSNs con navitoclax y se recubrieron con un péptido específico de MMP-3 (“puerta molecular”), obteniendo NPs(Nav)@MMP-3. Los estudios celulares demostraron una liberación preferencial de la carga en células senescentes en comparación con células proliferantes. Además, el tratamiento de células senescentes con NPs(Nav)@MMP-3 indujo una disminución de la viabilidad celular similar a la del navitoclax, mientras que se observó un efecto protector sobre las células proliferantes.Partiendo de estos resultados en el segundo capítulo experimental describimos una nanopartícula para terapia senolítica mediada por células inmunitarias. Para ello, las nanopartículas recubiertas con el péptido específico de MMP-3 se decoraron con la quimioquina CXCL12 (NPs@CXCL12), potenciando el reclutamiento de células inmunitarias al microambiente senescente. Se verificó la liberación progresiva y específica de la proteína CXCL12 en presencia de MMP-3 mediante ensayos de liberación controlada. Posteriormente, se confirmó la capacidad de las nanopartículas para atraer células T Jurkat a un microambiente senescente mediante ensayos de migración. Los resultados revelaron que las NPs@CXCL12 ejercían un efecto quimiotáctico más significativo que la CXCL12 libre. Además, también se evaluó la capacidad de las células asesinas naturales primarias humanas para eliminar WI-38 senescentes, y se monitorizaron sus trayectorias de migración en respuesta a NPs@CXCL12 o CXCL12 libre utilizando un dispositivo de microfuídica. En el capítulo experimental tres, nos centramos en el diseño de un nanodispositivo dirigido al surfaceoma senescente. En concreto, demostramos que la inducción de la senescencia con palbociclib en células de melanoma humano desarrollaba un fenotipo senescente con sobreexpresión de dipeptidil peptidasa-4 (DPP4). Aquí, se cargaron MSNs con navitoclax, se cubrieron con polietilenglicol que contiene disulfuro (“puerta molecular” sensible a redox) y se funcionalizaron con un anticuerpo contra DPP4. La eficacia de las NPs(Nav)@DPP4-PE en la detección y eliminación de células senescentes se validó in vitro e in vivo utilizando un modelo murino de melanoma senescente inducido por palbociclib. El tratamiento redujo significativamente el crecimiento tumoral y eliminó preferentemente las células senescentes. En el cuarto capítulo experimental, investigamos el potencial de la terapia fotodinámica para la detección y eliminación de células senescentes. Para ello, se sintetizó un fotosensibilizador (compuesto 1) basado en boro-dipirrometeno (BODIPY) activado con β-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-gal). El compuesto 1 permanece inactivo hasta que la hidrólisis de la galactosa por la enzima SA-β-gal restaura la emisión de fluorescencia y la generación de oxígeno singlete. La restauración de la fluorescencia, la capacidad de producir especies reactivas de oxígeno y de matar células senescentes en presencia de luz en el compuesto 1 se demostró en modelos de senescencia inducida por terapia in vitro e in vivo. Además, los estudios revelaron que el compuesto 1 desencadena un potente efecto senolítico tras la irradiación de tumores senescentes en modelos de ratón.